Изворни код странице Циркуларни дихроизам

'''Циркуларни дихроизам (ЦД)''' заснива се на различитој апсорпцији десно и лево кружно поларизоване [[светлост]]и која је последица структурне асиметрије.<ref name="Fasman">{{Cite book |author=Fasman, G.D. |title=Circular dichroism and Conformational Analysis of Biomolecules |year=1996|publisher=Plenum press |location=New York}}</ref> Уређене структуре имају ЦД сигнале док неуређене немају. ЦД [[спектроскоп]]ија је метода која се користи за утврђивање [[Стереоизомерија|оптичке изомерије]] [[молекул]]а, а и за одређивање [[секундарна структура протеина|секундарне]] и [[Терцијарна структура протеина|терцијарне структуре]] [[протеин]]а<ref name="Практикум1_2007">{{Cite book |author=А. Поповић-Бијелић, М. Мојовић |title=Практикум из биофизичке хемије |publisher=Универзитет у Београду- Факултет за физичку хемију |issue=1. |year=2007|location=Београд}}</ref>.

== Порекло елиптицитета ==
[[Датотека:Circular dichroism.png|мини|десно|200п|Приказ различите апсорпције десно и лево кружно поларизоване светлости]] 

Због асиметричне расподеле наелектрисања код оптички активних молекула, десно и лево кружно поларизовани таласи ће се кретати различитим брзинама (због различитих [[индекс преламања|индекса преламања]], -{n<sub>D</sub>}- ≠ -{n<sub>L</sub>}-). Као последица тога, [[фазни померај]] између лево и десно кружно поларизованог таласа после проласка кроз [[оптички активна средина|оптички активну средину]] ће бити различит од оног пре проласка кроз оптички активну средину, па ће [[раван поларизације]] [[линеарно поларизована светлост|линеарно поларизоване светлости]] после проласка кроз оптички активну средину бити закренута за одређени угао у односу на раван поларизације линеарно поларизованог упадног снопа.<ref name="Hecht">{{Cite book |author=Hecht, E. |title=Optics |url=https://archive.org/details/optics0000hech_e5d5 |edition=3rd |year=1998|publication=Addison Wesley Longman |location=Massachusetts}}</ref> Ако су за дату оптички активну супстанцу различити и [[моларни апсорпциони коефицијент]]и за десно и лево кружно поларизовану светлост (ε<sub>D</sub> ≠ ε<sub>L</sub>) излазни сноп ће бити елиптично поларизован<ref name="Практикум1_2007" />.

За дату таласну дужину, разлика између апсорбанције лево кружно поларизоване и десно кружно поларизоване светлости (ова величина се обично мери):

:<math>\Delta A=A_L-A_D \,</math> 
                 
Применом [[Беров закон|Беровог закона]] добијамо следећу зависност:

:<math>\Delta A = (\epsilon_L - \epsilon_D)Cl\,</math>
                 
где су:
:-{ε<sub>L</sub>}- и -{ε<sub>D</sub>}- моларни апсорпциони коефицијенти за лево кружно поларизовану и десно кружно поларизовану светлост,
:''-{C}-'' моларна концентрација
:''-{l}-'' дужина пута у центиметрима (-{cm}-).
 
Тада је:

:<math> \Delta \epsilon =\epsilon_L-\epsilon_D\,</math>

моларни циркуларни дихроизам. На ову величину се најчешће мисли под појмом циркуларни дихроизам супстанце. Иако се често мери -{ΔА}-, уобичајено је да се ексцентрицитет елиптично поларизоване светлости изрази величином која се зове [[елиптицитет]] (θ), θ = -{[[аркус тангенс|arctan]]}- (-{а/b}-). Да би било могуће поређење елиптицитета за узорке различитих концентрација потребно је изразити елиптицитет по јединици концентрације, или по броју резидуа. Зато се уводи нова величина - моларни елиптицитет [θ].<ref>{{cite web |url=http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/course/section8/ss-960531_21.html |title=Circular dichroism spectroscopy }}{{Мртва веза}}</ref>

[[Датотека:Electric Vectors 1.png|200п|мини|десно|Елиптично поларизована светлост (љубичаста) је састављена од различитих доприноса десно (плава) и лево (црвена) циркуларно поларизоване светлости]]

Моларни циркуларни дихроизам и [[моларни елиптицитет]], [θ], повезани су следећом једначином:

:<math> [\theta] = 3,298.2\Delta \epsilon\, </math>

Ова веза је изведена из дефинисања елиптицитета поларизације као:

:<math> tan \theta = \frac{E_D - E_L}{E_D + E_L} \,</math>
 
где су ''-{E<sub>D</sub>}-'' and ''-{E<sub>L</sub>}-'' величине вектора електричног поља десно-кружно и лево-кружно поларизоване светлости.

Када је ''-{E<sub>D</sub>}-'' једнако ''-{E<sub>L</sub>}-'' (када нема разлике у апсорпцији десно и лево-кружно поларизоване светлости), θ = 0° и светлост је линеарно поларизована. Када је или ''-{E<sub>D</sub>}-'' или ''-{E<sub>L</sub>}-'' једнако нули, θ је 45° и светлост је кружно поларизована. 

Како је ефекат циркуларног дихроизма мали, односно -{''tan'' θ}- има малу вредност и може се апроксимирати са θ у радијанима. Интензитет светлости, -{I}-, пропорционалан је квадрату вектора електричног поља, тако да елиптицитет постаје:
                           
:<math> \theta (radians) = \frac{(I_D^{1/2} - I_L^{1/2})}{(I_D^{1/2} + I_L^{1/2})}\,</math>

Затим можемо изразити интензитете у претходној једначини коришћењем Беровог закона у облику природног логаритма:

:<math> I = I_0 e^{-A\ln{10}}\,</math>

Елиптицитет сада може бити написан као:

:<math> \theta (rad) = \frac{(e^{\frac{-A_D}{2}ln10} - e^{\frac{-A_L}{2}ln10})}{(e^{\frac{-A_D}{2}ln10} + e^{\frac{-A_L}{2}ln10})} = \frac{e^{\Delta A \frac{ln10}{2}} - 1}{e^{\Delta A \frac{ln10}{2}} + 1} \,</math>

Када је -{ΔА<<1}-, овај израз може бити апроксимиран развијањем експоненцијалних чланова у [[Тејлоров ред]] до првог степена (можемо занемарити чланове виших степена) и затим занемаривањем -{ΔА}- у поређењу са јединицом, као и претварањем радијана у степене добијамо следећи израз:

:<math> \theta (deg) = \Delta A \left(\frac {ln10}{4} \right) \left(\frac {180}{\pi} \right)\, </math>

Линеарна зависност концентрације раствора и дужине пута је уклоњена дефинисањем моларног елиптицитета као:

:<math> [\theta] = \frac {100\theta}{Cl}\, </math>

Онда комбиновањем последња два израза са Беровим законом, моларни елиптицитет постаје:

:<math> [\theta]= 100 \Delta \epsilon \left(\frac {ln10}{4} \right) \left(\frac {180}{\pi} \right) = 3,298.2\Delta \epsilon \,</math>

Моларни елиптицитет зависи од природе супстанце и таласне дужине упадног зрачења.

Графички представљена зависност моларног елиптицитета неке супстанције од таласне дужине упадног зрачења, -{[θ] = f(λ)}-, зове се ''спектар циркуларног дихроизма'' или ЦД спектар дате супстанције<ref name="Практикум1_2007" />.

== Примена на биолошке молекуле ==

Скоро сви биолошки молекули су оптички активни. Како се ЦД примењује на апсорпционе траке било ког оптички активног молекула, он ће бити примењен за биолошке молекуле, због десне ротације (нпр. неки [[шећер]]и) и леве ротације (нпр. неке [[аминокиселина|аминокиселине]]) коју они поседују. Такође можемо одредити [[секундарна структура proteina|секундарну структуру]] посматрањем ЦД за дати молекул. Дакле, [[алфа хеликс]] [[протеин]]а и дупли (дволанчани) хеликс нуклеинских киселина имају карактеристичне ЦД спектре за своје структуре.

ЦД је уско повезан са техником оптичке ротационе дисперзије (ОРД), с тим што се ЦД сматра напреднијом техником. ЦД се мери близу апсорпционих трака од интереса, док се ОРД може мерити далеко од ових трака. Међутим, због дисперзионе природе ОРД, ЦД је осетљивија аналитичка метода. У принципу, ова два мерења могу бити повезана [[Кониг-Крамерова трансформација|Кониг-Крамеровим]] трансформацијама, ако су све апсорпције обухваћене мерењем.

Ултраљубичасти ЦД спектар протеина може предвидети важне карактеристике њихове [[секундарна структура proteina|секундарне структуре]]. Предикција секундарне структуре заснива се на претпоставци да је ЦД спектар протеина, због изразите оптичке активности пептидне [[хромофор]]е, одраз његове секундарне структуре. За пептидну хромофору карактеристични су -{n -> π*}- прелаз на 220-{nm}- и π -> π* прелаз на 190 -{nm}-. Процену структуре протеина се врши помоћу ЦД спектара синтетичких полимера који имају структуру 100% [[Алфа хеликс|α-хеликса]], 100% [[Бета раван|β-равни]], 100% насумичног клупка (случајна структура) итд. Ова фракционална именовања важна су јер упућују на могуће секундарне конформације у којима може бити протеин. На пример, поли-Л-лизин -{{(Lys)n}}- може усвојити 3 различите конформације само за различите вредности -{[[pH вредност|pH]]}- и температуре: насумично клупко на -{pH}- 7,0 ; [[Алфа хеликс|α-хеликс]] на -{pH}- 10,8 ; [[Бета раван|β-облик]] на -{pH}- 11,1 после загревања до 52°C и хлађења.

[[Датотека:CD spektri.JPG|200п|лево|мини|ЦД спектри синтетичких полимера који имају структуру 100% [[Алфа хеликс|α-хеликса]], 100% [[Бета раван|β-равни]] и 100% насумично клупко.<ref>{{Cite web |url=http://www.newark.rutgers.edu/chemistry/grad/chem585/lecture1.html |title=www.newark.rutgers.edu/chemistry/grad/chem585/lecture1.html |access-date=04. 06. 2007 |archive-url=https://web.archive.org/web/20060912055940/http://www.newark.rutgers.edu/chemistry/grad/chem585/lecture1.html |archive-date=12. 09. 2006 |url-status=dead |df= }}</ref>.]]

ЦД спектар непознатог протеина = -{f<sub>α</sub>S<sub>α</sub>(λ) + f<sub>β</sub>S<sub>β</sub>(λ) + f<sub>RC</sub>S<sub>RC</sub>(λ)}-, где су -{S<sub>α</sub>(λ), S<sub>β</sub>(λ)}-, и -{S<sub>RC</sub>(λ)}- изведене из основног спектра поли-Л-лизина. Недостатак ове методе је то што иако је лако добити вредности за -{S<sub>α</sub>(λ), S<sub>β</sub>(λ)}-, и -{S<sub>RC</sub>(λ)}- из директних мерења, оне нису увек усаглашене од једне лабораторије до друге. Такође, мора се узети у обзир и дужина ланца и утицај [[агрегатна стања|агрегатног стања]] овог скупа база спектра. Међутим, овај метод је обично тачан до 10% за садржај [[Алфа хеликс|α-хеликса]].

На основу ЦД-а не може се тачно рећи на ком месту у молекулу се дати α-хеликси налазе, па чак ни предвидети колико их има. Упркос овоме, ЦД је драгоцен алат, нарочито за показивање конформацијских промена. На пример, може се користити за одређивање зависности секундарне структуре молекула од температуре или концентрације денатурисаних агенаса. На тај начин он може дати важну термодинамичку информацију о молекулу која не може иначе бити лако добивена. Било који покушај испитивања протеина ће довести до закључка да је ЦД значајан за проверавање да ли је дати протеин у својој нативној (савијеној) конформацији пре његовог подвргавања скупим и/или дугим експериментима. 

За одређивање [[секундарна структура proteina|секундарне структуре]], посматрају се спектри у далекој -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области (190-250 -{nm}-) и уколико је протеин у нативној (савијеној) конформацији – пептидна веза ће давати ЦД сигнал.

За одређивање [[Терцијарна структура протеина|терцијарне структуре]], посматрају се ЦД спектри у блиској -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области (250-350 -{nm}-) и уколико је протеин у нативној конформацији, ЦД сигнали ће потицати од ароматичних аминокиселина и [[дисулфидни мост|дисулфидних мостова]]. Сигнали у области од 250-270 -{nm}- потичу од фенилаланина, од 270-290 -{nm}- од тирозина и од 280-300 -{nm}- од [[триптофан]]а. [[Дисулфидна веза|Дисулфидне везе]] дају широке, слабе сигнале у целој блиској -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области. Уколико не постоји никакав сигнал у области од 250-350 -{nm}-, значи да се протеин не налази у нативној конформацији.<ref name="Практикум1_2007" />.

ЦД даје мање специфичну информацију о структури од нпр. рендгено-структурне анализе или [[Нуклеарна магнетна резонанција|НМР]] спектроскопије протеина, које дају податке о атомима. Међутим, ЦД спектроскопија је брза метода, која не захтева велике количине протеина, нити дугу обраду података. ЦД се може користити за испитивање услова растворљивости, промене температуре, -{[[pH вредност|pH]]}-, [[јонска јачина|јонске јачине]] и присуства различитих фактора.

ЦД спектроскопија се обично користи за проучавање протеина у растворима, и као допунска метода за проучавање чврстог стања. Овде такође постоји ограничење, јер се многи протеини убачени у мембране налазе у свом нативном стању, па су раствори мембрана нехомогени због чега расејавају светлост. ЦД се понекад мери у танким филмовима.

== Експериментална ограничења ==

ЦД може да се користи и за проучавање [[угљени хидрат|угљених хидрата]], али са ограниченим успехом због тешкоћа повезаних са снимањем ЦД спектра у вакуум ултраљубичастој ([[ултраљубичасто зрачење|-{VUV}-]]) области спектра (100-200 -{nm}-), где одговарајуће ЦД траке несупституисаних [[угљени хидрат|угљених хидрата]] леже. Спектри супституисаних угљених хидрата са тракама изнад [[ултраљубичасто зрачење|-{VUV}-]] области се успешно снимају .

Мерења ЦД-а такође су компликована због чињенице да водени јонски [[пуфер]]ски системи често апсорбују у области где структурне особине показују различиту апсорпцију кружно поларизоване светлости. При снимању ЦД спектара [[фосфат]]них, [[сулфат]]них, [[карбонат]]них и [[ацетат]]них [[јон]]а морају се користити веома разблажени раствори. [[Борати]] и [[амонијум соли]] се често користе за одређивање одговарајуће -{pH}- области за ЦД пробе. За повећање јонске јачине, неки експериментатори замењују хлоридни јон флуоридним, јер флуоридни јон апсорбује мање у далекој -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области, а неки раде у чистој води. Други начин да се минимизира апсорпција растварача је примена ужих ћелија, чиме се смањује пут светлости кроз испитивани узорак (обично када се ради у далекој -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области користе се ћелије ширина до 0,1 -{mm}- ).

ЦД спектри протеина коришћени за процену [[секундарна структура протеина|секундарне структуре]] повезани су са π - π* прелазима, који су последица апсорпције [[амидна веза|амидне везе]]. Ове апсорпционе траке леже делимично у вакуумској ултраљубичастој области (таласне дужине мање од 200 -{nm}-). Област ове таласне дужине је неприступачна због снажне апсорпције [[кисеоник]]а, тако да је снимање на инструментима ослобођеним од [[кисеоник]]а (пуњеним чистим гасом [[азот]]ом) неопходно. 

Када је уклоњен [[кисеоник]], други најважнији технички фактор у раду испод 200 -{nm}- је да остатак оптичког система има мање губитке у овој области. Зато треба користити [[алуминијум|алуминизирана]] огледала чији премази су оптимизирани за низак губитак у овој области спектра.

Такође је потребно да се достигне адекватан однос [[сигнал-шум однос|сигнал-шум]] (-{S/N}- је пропорционално квадратном корену дела времена за које се снима спектар). Зато је потребно 30-60 мин. да се сниме спектри за одређивање [[секундарна структура протеина|секундарне структуре]] (плус исти део времена за базну линију за сваки ЦД спектрометар).

Уобичајен извор светлости у овим инструментима је кратко-лучна [[ксенонска лампа]] под високим притиском. Обичне ксенонске лучне лампе су неприкладне за употребу у далекој -{[[Ултраљубичасто зрачење|UV]]}- области. Уместо специјално саграђених лампи са омотима направљеним од синтетике високе чистоће, растопљени [[силикати]] морају бити употребљени. Светлост са извора синхротрона има много већи флукс на краћим таласним дужинама и коришћена је за ЦД испод 160 -{nm}-.

На нивоу [[квантна механика|квантне механике]], садржај информација ЦД-а и [[оптичка ротација|оптичке ротације]] је идентичан.

== Извори ==
{{reflist|2}}

== Литература ==
* {{Cite book |ref= harv|author=Fasman, G.D. |title=Circular dichroism and Conformational Analysis of Biomolecules |year=1996|publisher=Plenum press |location=New York}}
* {{Cite book |ref= harv|author=А. Поповић-Бијелић, М. Мојовић |title=Практикум из биофизичке хемије |publisher=Универзитет у Београду- Факултет за физичку хемију |issue=1. |year=2007|location=Београд}}
* {{Cite book |ref= harv|author=Hecht, E. |title=Optics |url= https://archive.org/details/optics0000hech_e5d5|edition=3rd |year=1998|publication=Addison Wesley Longman |location=Massachusetts}}

== Спољашње везе ==
* -{[http://www.ap-lab.com/circular_dichroism.htm Circular Dichroism explained] - A commercial supplier's site, but very good information with examples, etc.}-
* -{[https://web.archive.org/web/20090429064346/http://www2.umdnj.edu/cdrwjweb/index.htm#software Circular Dichroism at UMDNJ] - a good site for information on structure estimation software}-
* -{[https://web.archive.org/web/20070422235859/http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo1.htm Electromagnetic waves] - Animated electromagnetic waves}-

{{-}}
{{Секундарна структура протеина}}
{{Методе за одређивање структуре протеина}}
{{Спектроскопија}}

{{нормативна контрола}}

[[Категорија:Поларизација]]
[[Категорија:Структура протеина]]
[[Категорија:Биофизичка хемија]]
[[Категорија:Физичке величине]]